ERM-DA482 腦脊液中的ABETA 42標準品是三種腦脊液（腦脊液）認證的參考物質(CRMs)的一部分，其中包含不同水平的淀粉樣β1-42肽(Aβ1-42)。這三個crm(ERM-DA480/IFCC、ERMDA481/IFCC和ERM-DA482/IFCC)是在歐盟委員會聯(lián)合研究中心的責任下生產和認證的。制備ERM-DA482/IFCC的起始材料是通過連續(xù)腰椎引流術從常壓腦積水患者中收集的人腦脊液。

制備工藝與定值技術

1. 生產質控體系

遵循 JRC-IRMM 蛋白類參考物質制備規(guī)范（IRMM/ENV 15144）及 ISO 17034 要求，核心流程聚焦 ABETA 42 的穩(wěn)定性與純度控制：

重組表達與純化：將ERM-DA482 腦脊液中的ABETA 42標準品 ABETA 42 基因克隆至 pET-28a 載體，HEK293 細胞懸浮培養(yǎng)，采用鎳柱親和層析（His 標簽純化）→ 離子交換層析（Q Sepharose）→ 凝膠過濾層析（Superdex 75）三步純化，SDS-PAGE 驗證純度≥99%，HPLC 檢測聚集率＜1%；

基質匹配與凍干：將純化 ABETA 42 與去蛋白腦脊液按比例混合，程控凍干（預凍 - 70℃，升華壓力 0.05 mbar，解析干燥 48 h），確保蛋白回收率≥92%，凍干后水分含量＜3%；

質控驗證：通過圓二色譜（CD）驗證 ABETA 42 二級結構（β 折疊含量＜10%，避免提前聚集），-80℃儲存穩(wěn)定性已驗證 36 個月（濃度衰減≤4%），瓶間均勻性采用 LC-MS/MS 檢測（CV≤2.5%）。

2. 聯(lián)合定值方法

采用國際臨床化學聯(lián)合會（IFCC）推薦的 LC-MS/MS 參考方法，聯(lián)合 5 家國際權l(xiāng)威機構（德國 BAM、法國 LNE、英國 NPL、美國 NIST、中國計量院）同步定值，核心流程：

樣品前處理：ERM-DA482 腦脊液中的ABETA 42標準品溶解后，加入 13C/15N 同位素標記的 ABETA 42 內標（濃度 20 pg/mL），胰蛋白酶酶解（37℃，4 h），固相萃取（SPE，C18 柱）富集肽段；

LC-MS/MS 檢測：采用反相色譜柱（Acquity UPLC BEH C18，2.1×100 mm），流動相為 0.1% 甲酸水 - 0.1% 甲酸乙腈，梯度洗脫（乙腈 0-40%，30 min），三重四極桿質譜（AB Sciex QTRAP 6500）多反應監(jiān)測（MRM）模式，監(jiān)測特征肽段（m/z 622.3→776.4，內標 m/z 625.3→782.4）；

定值一致性與不確定度：5 家機構檢測結果相對偏差≤3.2%，不確定度主要來源于：酶解效率波動（貢獻 35%）、質譜響應偏差（貢獻 28%）、基質不均勻性（貢獻 20%），最終擴展不確定度（k=2）為 5.2%-12.0%。

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